«В кишечнике термитов есть несколько сотен различных видов микробов, которые живут в пределах миллиметра друг от друга. Мы знаем, что определенные микробы присутствуют в кишечнике, и мы знаем, что микробы отвечают за определенные функции, но до сих пор мы этого не делали». «У меня есть хороший способ узнать, какие микробы что делают», — говорит Джаред Ледбеттер, профессор микробиологии окружающей среды в Калифорнийском технологическом институте, в лаборатории которого проводилась большая часть исследований. Он также является автором статьи о работе, опубликованной 16 сентября в онлайн-выпуске Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS).Ацетогенез — это производство ацетата (источника питания для термитов) из углекислого газа и водорода, вырабатываемых простейшими в кишечнике при расщеплении гниющей древесины.
В своем исследовании «кто что и где делает» Ледбеттер и его коллеги исследовали весь пул микробов кишечника термитов, чтобы определить конкретные гены организмов, ответственных за ацетогенез.Исследователи начали с анализа РНК микробов — генетической информации, которая может предоставить снимок генов, активных в определенный момент времени.
Используя РНК из общего пула микробов кишечника термитов, они искали активно транскрибируемые гены формиатдегидрогеназы (FDH), которые, как известно, кодируют белок, необходимый для ацетогенеза. Затем, используя метод, называемый мультиплексной микрофлюидной цифровой полимеразной цепной реакцией (цифровая ПЦР), исследователи изолировали ранее не изученные отдельные микробы в крошечные отсеки, чтобы идентифицировать настоящие виды микробов, несущие каждый из генов FDH. Некоторые из генов FDH были обнаружены у видов бактерий, известных как спирохеты — ранее предсказанного источника ацетогенеза. Тем не менее, оказалось, что эти спирохеты сами по себе не могут объяснить весь ацетат, производимый в кишечнике термитов.
Первоначально исследователи Калифорнийского технологического института не смогли идентифицировать микроорганизм, экспрессирующий единственный наиболее активный ген FDH в кишечнике. Тем не менее, первые авторы исследования, Адам Розенталь, доктор биологических наук из Калифорнийского технологического института, и Синнинг Чжан (доктор философии ’10, экологические науки и инженерия) заметили, что этот ген был более распространен в той части кишечного экстракта, которая содержит древесину. куски и более крупные микробы, такие как простейшие.
После анализа экстракта толстой кишки они обнаружили, что единственный наиболее активный ген FDH кодируется ранее не изученными видами из группы микробов, известных как дельтапротеобактерии. Это было первым доказательством того, что значительное количество ацетата в кишечнике может вырабатываться неспирохетами.Поскольку гены этой дельтапротеобактерии были обнаружены в крупных твердых частицах кишечника термитов, исследователи подумали, что, возможно, недавно идентифицированный микроб прикрепляется к поверхности одного из кусочков.
Чтобы проверить эту гипотезу, исследователи использовали метод визуализации с цветовой кодировкой, называемый гибридизационной цепной реакцией-флуоресцентной гибридизацией in situ, или HCR-FISH.Методика, разработанная в лаборатории Найлза Пирса, профессора прикладной и вычислительной математики и биоинженерии в Калифорнийском технологическом институте и соавтора исследования PNAS, позволила исследователям одновременно «раскрасить» клетки, экспрессирующие как активный ген FDH, так и ген. одновременное выявление дельтопротеобактерий с разными флуоресцентными цветами. «Эксперимент с микрофлюидикой показал, что два цвета должны быть выражены в одном месте и в одной и той же крошечной ячейке», — говорит Ледбеттер. И действительно, были. «Благодаря этому подходу мы смогли действительно увидеть, где обитает новая дельтапротеобактерия.
Как оказалось, клетки живут на поверхности очень специфического простейшего, производящего водород».Эта ассоциация между двумя организмами имеет смысл, исходя из того, что известно о сложной пищевой сети кишечника термитов, говорит Ледбеттер. «Здесь у вас есть большая одиночная клетка эукариот — простейшее, — которое вырабатывает водород при разложении древесины, и у вас есть гораздо более мелкие потребляющие водород дельтапротеобактерии, прикрепленные к ее поверхности», — говорит он. «Итак, эта новая ацетогенная бактерия прижалась к источнику водорода настолько близко, насколько это возможно».Эти интимные отношения, говорит Ледбеттер, никогда не могли быть обнаружены, полагаясь на филогенетический вывод — стандартный метод сопоставления функции с конкретным организмом. «Используя филогенетический вывод, мы говорим:« Мы много знаем о родственниках этого гипотетического организма, поэтому, даже не видя организм, мы собираемся предположить, с кем он связан », — говорит он. «Но с помощью методов, использованных в этом исследовании, мы обнаружили, что наше первоначальное предсказание было неверным.
Важно отметить, что мы смогли определить конкретный ответственный организм и местоположение загадочного организма, которые, по-видимому, чрезвычайно важны для потребления водород и превращение его в продукт, который может использовать насекомое ". Эти результаты не только определяют новый источник ацетогенеза в кишечнике термитов — они также раскрывают ограничения, связанные с предсказаниями, основанными исключительно на филогенетических отношениях.