Пользуясь своим открытием надежности «цифровых» количественных анализов или количественных анализов отдельных молекул, исследователи из Калифорнийского технологического института (Caltech) продемонстрировали метод использования устройства «лаборатория на кристалле» и мобильного телефона для определения концентрация молекул, таких как молекулы РНК ВИЧ, в образце. Этот цифровой подход может последовательно предоставлять точную количественную информацию, несмотря на изменения во времени, температуре и условиях освещения, что ранее было невозможно при использовании традиционных измерений.В исследовании, опубликованном 7 ноября в журнале Analytical Chemistry, исследователи из лаборатории Рустема Исмагилова, Этель Уилсон Боулз и профессора химии и химической инженерии Роберта Боулза использовали ВИЧ в качестве контекста для проверки надежности цифровых анализов. Чтобы оценить прогрессирование ВИЧ и рекомендовать соответствующие методы лечения, врачи должны знать концентрацию РНК-вирусов ВИЧ в кровотоке пациента, называемую вирусной нагрузкой.
Проблема в том, что тесты на вирусную нагрузку, используемые в Соединенных Штатах, например те, которые основаны на амплификации РНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), требуют громоздкого и дорогостоящего оборудования, обученного персонала и доступа к такой инфраструктуре, как электричество, и тому подобное. которые часто недоступны в условиях ограниченных ресурсов. Кроме того, поскольку в этих условиях сложно контролировать окружающую среду, тесты на вирусную нагрузку должны быть «надежными» или устойчивыми к таким изменениям, как колебания температуры и влажности.
Многие традиционные подходы к измерению вирусной нагрузки включают преобразование небольшого количества РНК в ДНК, которая затем умножается с помощью амплификации ДНК, что позволяет исследователям видеть, сколько ДНК присутствует в реальном времени после каждого раунда амплификации, путем мониторинга различной интенсивности флуоресцентный краситель, маркирующий ДНК. Эти эксперименты, известные как «кинетические» анализы, приводят к показаниям, отражающим изменения интенсивности во времени, которые называются кривой амплификации. Чтобы найти исходную концентрацию исходного образца РНК, кривую амплификации затем сравнивают со стандартными кривыми, представляющими известные концентрации РНК. Поскольку анализы, такие как тесты на ВИЧ, требуют много раундов амплификации ДНК для получения достаточно яркого флуоресцентного сигнала, небольшие ошибки, вызванные изменениями условий окружающей среды, могут увеличиваться экспоненциально, а это означает, что эти кинетические измерения недостаточно надежны, чтобы выдерживать изменяющиеся условия.
В этом новом исследовании исследователи выдвинули гипотезу, что они могут использовать подход цифрового усиления для создания надежного количественного метода. При цифровой амплификации образец разделяется на достаточно небольшие объемы, так что каждая лунка содержит либо одну целевую молекулу, либо вообще не содержит молекулу. Исмагилов и его коллеги использовали ранее изобретенное ими микрожидкостное устройство под названием SlipChip, чтобы отделить отдельные молекулы от образца, содержащего РНК ВИЧ. SlipChip состоит из двух пластин размером с кредитную карту, установленных друг на друга; образец сначала добавляется во взаимосвязанные каналы SlipChip, и с помощью одного «проскальзывания» верхнего чипа каналы превращаются в отдельные лунки.
Вместо ПЦР исследователи использовали другую химию амплификации на этом чипе, называемую цифровой амплификацией, опосредованной петлей обратной транскрипции (dRT-LAMP), которая дает яркий флуоресцентный сигнал в присутствии целевой молекулы во время процесса амплификации. Технология dRT-LAMP устраняет необходимость постоянного отслеживания интенсивности флуоресценции; вместо этого используется только одно измерение считывания конечной точки. Получающееся лоскутное одеяло из «положительных» или «отрицательных» лунок на устройстве в сочетании со статистическим анализом позволяет подсчитывать отдельные молекулы.«В каждой лунке вы проводите качественный эксперимент; результат похож на тест на беременность: либо да, либо нет, положительный или отрицательный, на наличие молекулы РНК ВИЧ», — говорит Дэвид Селк, аспирант лаборатории Исмагилова и первый автор исследования. «Но, проведя пару тысяч качественных экспериментов, вы в конечном итоге получите числовой, количественный результат: концентрацию молекул РНК ВИЧ в образце.
Вычисляя концентрацию по количеству лунок, содержащих флуоресценцию — и, следовательно, ВИЧ — вы используете надежность многих качественных экспериментов типа «да или нет», чтобы удовлетворить потребность в количественном, числовом результате », — говорит он.Когда исследователи сравнили результаты количественной оценки dRT-LAMP с результатами, полученными с помощью кинетической версии этого химического метода в реальном времени, RT-LAMP, они обнаружили, что цифровой формат обеспечивает точные результаты, несмотря на изменения температуры и времени, в то время как кинетический формат может нет. Это открытие дополняет объем исследований, проводимых лабораторией по надежности преобразования аналоговых сигналов (т.
Е. Показаний, отражающих изменение концентрации во времени) в серию положительных или отрицательных цифровых сигналов. В другой недавней статье, опубликованной в Журнале Американского химического общества, исследуется вариант этого аналого-цифрового преобразования.Группа Исмагилова также испытала способ получить изображение картины флуоресценции в лунках SlipChip и по этому изображению определить вирусную нагрузку без использования дорогих микроскопов или обученного персонала. Они обратились к почти повсеместной технологии 21 века: смартфонам.
Исследователи поместили SlipChip в импровизированную темную комнату (обувную коробку с отверстием наверху), а затем сфотографировали его лунки с помощью смартфона, оснащенного специальным фильтром, чтобы вспышка смартфона могла «возбуждать» флуоресцентную ДНК. краситель, и камера смартфона могла захватывать изображение флуоресценции. Полученные изображения были загружены в Microsoft SkyDrive, облачный сервер, где специальное программное обеспечение, разработанное исследователями, определяло концентрацию вирусной нагрузки и отправляло результаты обратно по электронной почте.
Эти возможности позволяют цифровому подходу надежно работать с автоматизированной обработкой, независимо от того, насколько плохими могут быть условия получения изображений. В качестве примера его простоты 5-летний ребенок смог использовать этот метод визуализации сотового телефона для получения количественных результатов с использованием цепей РНК, выделенных из неинфекционного вируса.«Мы были удивлены тем, что этот метод сотового телефона сработал, потому что и создание изображений с мобильных телефонов, и их автоматическая обработка подвержены ошибкам», — говорит Исмагилов. «Поскольку цифровые анализы включают простое различение положительных и отрицательных результатов, мы обнаружили, что даже эти подверженные ошибкам подходы могут использоваться для надежного подсчета отдельных молекул».Тот факт, что этот метод устойчив не только к изменениям времени и температуры, но также подходит для обработки изображений и автоматической обработки сотовых телефонов, делает его многообещающей технологией для настроек с ограниченными ресурсами. «Мы считаем, что наши выводы о надежности цифрового усиления могут сигнализировать о серьезном изменении парадигмы в том, как количественные измерения проводятся дома, в полевых условиях и в развивающихся странах», — говорит Исмагилов.
Однако исследователи подчеркивают, что есть еще возможности для улучшения. «В то время как в этом исследовании мы изучали надежность и использовали очищенную РНК, следующее поколение устройств будет выделять молекулы РНК ВИЧ непосредственно из крови пациентов», — говорит Бинг Сан, аспирант лаборатории Исмагилова и первый автор исследования. «Мы также адаптируем устройства для других вирусов, таких как гепатит С. Объединив эти улучшения с методом визуализации сотового телефона, мы планируем создать что-то, что действительно можно было бы использовать в реальном мире», — добавляет Сан.