«В большинстве сред фагов примерно в десять раз больше, чем бактерий. И, как и все вирусы, фаги используют механизм репликации клетки-хозяина для создания своих копий», — говорит профессор Ротем Сорек из отдела молекулярной генетики Института Вейцмана. «И они постоянно разрабатывают новые способы сделать это. Так что бактериям нужна очень активная иммунная система, чтобы выжить».Но до недавнего времени ученые не были уверены даже в том, что у бактерий есть так называемая адаптивная иммунная система — та, которая «помнит» прошлый контакт, чтобы вызвать целенаправленный ответ.
Ситуация изменилась несколько лет назад, когда была открыта бактериальная адаптивная система под названием CRISPR. Иммунный механизм CRISPR имеет решающее значение не только для бактерий, он оказывает большое влияние на нашу повседневную жизнь: сегодня он используется, например, для защиты «хороших» бактерий, из которых делают йогурт и сыр.
И это также может повлиять на наше будущее: ученые придумали, как использовать гениальную систему CRISPR для «редактирования» генома человека, что сделало ее удобным инструментом для широкого круга клинических приложений.Чтобы запомнить инфекцию, система CRISPR извлекает короткую последовательность из вторгающейся вирусной ДНК и вставляет ее прямо в бактериальный геном. Кусочки фаговой ДНК хранятся в специальных участках генома; они формируют иммунную память. При последующих заражениях CRISPR использует эти последовательности для создания коротких цепей РНК, которые соответствуют генетической последовательности родственников фагов.
Белковые комплексы, прикрепленные к РНК, затем идентифицируют ДНК фага и разрушают ее.Селективность явно является проблемой для такой системы: предыдущие исследования в лаборатории Сорека показали, что ошибочный захват фрагментов собственной ДНК может вызвать у бактериальной клетки своего рода аутоиммунное заболевание, при котором она атакует свою собственную ДНК, и результаты могут быть смертельный для бактерий.
По словам Сорека, когда в клетке примерно в 100 раз больше собственной, чем чужеродной ДНК, может быть место для гораздо большего количества ошибок, чем на самом деле наблюдали исследователи.Откуда система CRISPR знает, как вставлять чужеродные, а не собственные фрагменты ДНК в иммунную память? Сорек и его студент Асаф Леви объединились с профессором Уди Кимроном и Мораном Гореном из Тель-Авивского университета, чтобы подробно ответить на вопрос, раскрывая сложный, многоэтапный механизм для этой части процесса CRISPR.
Они разработали экспериментальную установку, используя плазмиды — короткие круглые части ДНК, имитирующие вирусы, — и ввели их в клетки бактерий. У этих бактерий были два белка, известные как Cas1 и Cas2 — части системы CRISPR, которые отвечают за получение фрагментов чужеродной ДНК. Система CRISPR успешно включила плазмидную ДНК в бактериальный геном, в то время как «собственная» ДНК подвергалась атаке лишь изредка.
Команда зафиксировала около 38 миллионов отдельных случаев иммунизации.При более внимательном рассмотрении результатов команда обнаружила, что система CRISPR, использующая белки Cas 1 и 2, специально идентифицирует ДНК, которая быстро реплицируется. Таким образом, по иронии судьбы, именно тактика выживания фага — его запрограммированное стремление к воспроизведению любой ценой — оказывается его крахом.«Тем не менее, — говорит Сорек, — это не полностью объясняет, как система CRISPR различает« я »и« не-я »».
Решение пришло из более глубокого понимания процесса. Во время репликации ДНК в ДНК часто происходят небольшие разрывы; эти разрывы вызывают фермент репарации ДНК, который «поедает» часть разорванной ДНК. Команда обнаружила, что «остатки» от откусывания ремонтного оборудования на самом деле являются источником вирусной ДНК, используемой системой CRISPR для создания иммунной памяти бактерии. Но когда этот репаративный фермент встречается с короткой последовательностью, называемой «сайтом Ци», его покалывание прекращается.
Такие последовательности Chi очень часто встречаются по всему бактериальному геному, но редко в вирусном. Таким образом, сайты Chi также служат в качестве «собственных» маркеров: они отвергают активность механизма CRISPR, когда они присутствуют, но позволяют ему использовать фрагменты фаговой ДНК, если они отсутствуют.
Таким образом, бактериальная клетка использует свои нормальные процессы репликации и репарации ДНК для идентификации ДНК фага, проверяя и перепроверяя, что новая ДНК отличается двумя фундаментальными способами от «собственного» генома. Благодаря активности двух белков CRISPR — Cas1 и 2 — бактериальная иммунная система может гарантировать, что она сама добавляет чужеродную ДНК в свою иммунную «память» и, таким образом, может активировать свою защиту.
Сорек: «Решение загадки« я »и« не-я »для бактериальной иммунной системы и расшифровка точного механизма этого шага в процессе CRISPR дает нам важное представление о невидимой конфронтации, которая происходит повсюду, вокруг нас, все время. . " Кимрон: «Бактериальное решение для предотвращения аутоиммунитета может быть использовано в будущих клинических приложениях, использующих преимущества системы CRISPR».