Новый метод, о котором сообщается в выпуске журнала Nature на этой неделе, является значительным достижением, поскольку его можно применять к большому набору белков одновременно, даже к тысячам различных белков непосредственно в их естественной клеточной среде. Исследователи TSRI продемонстрировали метод поиска «лигандов» (партнеров по связыванию) для многих белков, которые, как ранее считалось, плохо связываются с небольшими молекулами, которые могут использоваться для определения функций их белковых мишеней и могут служить исходными соединениями для разработки лекарств.
Среди недавно открытых лигандов есть селективные ингибиторы двух ферментов каспаз, которые играют ключевую роль при множественных заболеваниях, но в значительной степени избегают попыток нацелить их с помощью лекарств.
«Наши данные показывают, что человеческий протеом гораздо более широко нацелен на небольшие молекулы, чем считалось ранее», — сказал главный исследователь Бенджамин Ф. Краватт, заведующий кафедрой химической физиологии и член Центра нейробиологии Дорриса и Института химической биологии Скаггса при TSRI. "Это открывает новые возможности для разработки научных исследований и, в конечном итоге, лекарств."
Использование фрагментов
Исследователи давно искали более эффективные способы идентификации низкомолекулярных лигандов для белков человека и определения того, какие белки в наших клетках являются "лигандируемыми" по своей природе."Биологи обычно использовали сложные компьютерные алгоритмы, чтобы предсказать, может ли данный класс белков адекватно связываться с небольшими молекулами.
Фармацевтические исследователи часто даже не пытаются разрабатывать лекарства для нацеливания на белки, которые считаются нелигандными. Считается, что к этой категории относятся несколько крупных классов белков, и до сих пор только около 600 из примерно 20000 белков человека были успешно нацелены на лекарственные препараты, одобренные FDA.
«На самом деле не было способа определить эмпирически, а не теоретически, какая часть протеома человека может быть нацелена на небольшие молекулы», — сказал Краватт.
Новый метод частично основан на подходе, известном как обнаружение лигандов на основе фрагментов, при котором используются молекулы-кандидаты в лиганды, размер которых составляет примерно половину малых молекул в лекарствах на основе таблеток.
Для первоначального поиска потенциальных лигандов такие «фрагментарные» молекулы намного более эффективны, чем молекулы размером с лекарство, и для тщательного поиска требуются гораздо меньшие библиотеки соединений.
Команда Краватта присоединила молекулы фрагментов-кандидатов к классу других молекул, которые, когда они могут подойти достаточно близко, сильно реагируют с аминокислотами цистеина на белках, блокируя лиганды с белками прочными «ковалентными» связями.
«Вам по-прежнему необходимо взаимодействие на основе аффинности, но событие ковалентного связывания обеспечивает значительное повышение эффективности», — сказал Керианн М. Бэкус, научный сотрудник лаборатории Cravatt, который является первым автором исследования с профессиональным научным сотрудником TSRI Бруно Коррейа.
Ученые разработали систему скрининга, в которой они могут применять эти ковалентно-связывающие молекулы фрагментов одну за другой ко всем коллекциям белков, экспрессируемых в клетках человека.
Этот метод можно использовать даже с интактными живыми клетками в культуральной чашке. Система позволяет исследователям обнаруживать и идентифицировать, какие низкомолекулярные фрагменты ковалентно связаны с какими белками в образцах и какие конкретные участки белков ответственны за связывание.
Применяя небольшую библиотеку цистеин-реактивных фрагментов к белкам, обнаруженным в двух типах раковых клеток человека, ученые обнаружили, что эти фрагменты успешно «лигнировали» более 750 различных цистеинов, обнаруженных в более чем 600 различных белках, что равняется более чем 20 процентов всех белков, проанализированных в образцах.
Многие из этих белков принадлежали к классам белков, таких как факторы транскрипции, которые считались практически нелигандируемыми и, следовательно, «неподдающимися обработке».«Фактически, около 85 процентов вновь образованных лигандов белков не перечислены в стандартной базе данных белков с известными низкомолекулярными лигандами.
«Этот эксперимент эффективно расширил то, что мы думаем о лигандируемом протеоме», — сказал Бакус.
Возможность разработки зондов и лекарств
Исследователи смогли подтвердить точность системы, например, показав, что она может идентифицировать известные белковые мишени ковалентно связывающегося противоракового препарата ибрутиниба.
Команда также продемонстрировала, что некоторые молекулы белок-связывающего лиганда, идентифицированные с помощью системы, обладают сильной биологической активностью и, таким образом, могут быть использованы в научных исследованиях или лекарствах. Например, недавно обнаруженные лиганды для ферментов IDH1 и IDH2, как оказалось, блокируют активность нормальных версий ферментов, а также мутантных версий, вызывающих многие виды рака.
В заключительной серии экспериментов команда показала, что один из идентифицированных лигандов ингибирует активность каспазы-8 и каспазы-10, двух ферментов, которые помогают включить процесс самоуничтожения клетки, известный как апоптоз.
Считается, что избыток апоптоза способствует возникновению нейродегенеративных состояний, таких как болезнь Альцгеймера и Хантингтона, а также повреждению головного мозга в результате инсультов и других травм головного мозга. Напротив, считается, что отсутствие апоптоза в некоторых клетках способствует развитию рака и аутоиммунных заболеваний. Однако ученые недостаточно понимают роль этих ферментов, поскольку им не удалось найти небольшие молекулы, которые избирательно ингибируют определенные каспазы.
В этом случае команда Краватта обнаружила, что их первоначально идентифицированный лиганд против каспазы работает путем связывания форм-предшественников каспазы-8 и -10. Они химически модифицировали лиганд в лиганд, который избирательно связывает только предшественник каспазы-8, и, используя два своих лиганда в качестве зондов, смогли обнаружить новые детали того, как каспаза-8 и -10 способствуют апоптозу в Т-клетках человека.
«По сути, мы продемонстрировали, что наша новая платформа работает и что мы можем использовать лиганды, которые она идентифицирует, для полезной биологии», — сказал Бэкус.
Бэкус и другие сотрудники лаборатории Cravatt в настоящее время проводят несколько дальнейших исследований: оптимизируют многие из недавно идентифицированных лигандов в зонды для изучения функций белков; составление более полного каталога цистеин-содержащих белков, которые можно лигировать; и расширение метода для нацеливания на другие аминокислоты, помимо цистеина.
«Некоторое время мы будем заняты, следя за этой разработкой, — сказал Краватт.