В значительной степени именно этот строго регулируемый процесс экспрессии генов делает нас полноценными, сложными существами, а не сгустком единомышленников.Несмотря на его важность, исследователи до сих пор не до конца понимают, как клетки получают доступ к соответствующей информации в ДНК. Они знают, что этот процесс контролируется белками, называемыми факторами транскрипции, которые связываются с определенными участками вокруг гена и — в правильной комбинации — позволяют считывать последовательность гена.
Однако, как известно, определить местонахождение функциональных сайтов связывания факторов транскрипции в ДНК очень сложно. Большое количество факторов транскрипции и типов клеток допускает бесконечное количество возможных комбинаций, из-за чего невероятно сложно определить, где, когда и как происходит каждое событие связывания. Более того, результаты усилий по картированию всего генома только усугубили путаницу, предполагая, что факторы транскрипции связываются очень беспорядочно повсюду, даже с сайтами, где они не включают и не выключают гены.
Теперь исследователи из Института медицинских исследований Стоуэрса разработали метод с высоким разрешением, который может точно и надежно картировать отдельные сайты связывания факторов транскрипции в геноме, что значительно превосходит стандартные методы.С новой техникой, которая была опубликована 9 марта 2015 года в Nature Biotechnology, сайты связывания факторов транскрипции, которые, вероятно, являются функциональными, оставляют четкие следы, указывая на то, что факторы транскрипции последовательно приземляются на очень специфические последовательности. Напротив, сомнительные сайты связывания, которые ранее определялись как связанные, демонстрировали более разбросанный неспецифический паттерн, который больше не считался связанным.
«Теперь мы можем увидеть тонкости и уровень точности, которых мы не ожидали», — говорит младший исследователь Стоуэрса Джулия Зейтлингер, доктор философии, ведущий автор исследования, в которое также входили коллеги Стоверса Ци Хэ, доктор философии. , и Джефф Джонстон. «Мы не только видим отдельный мотив последовательности, с которым связывается фактор транскрипции, но мы также видим дополнительные последовательности, которые, по-видимому, вносят вклад в специфичность связывания. Теперь мы можем прочитать гораздо больше информации, чтобы понять, как эти факторы действуют на генетические код, влияющий на выражение ".За последние 15 лет появился ряд методов, позволяющих исследователям картировать, где факторы транскрипции связываются с геномом. Все эти методы основаны на методе, называемом иммунопреципитацией хроматина или ChIP, который по существу привязывает белки к их положениям в ДНК, разбивает ДНК на управляемые фрагменты, а затем изолирует участки, которые связаны белками.
Исследователи использовали различные подходы для определения последовательности, содержащейся в этих разделах. ChIP-chip использует микрочипы или технологию генных чипов, чтобы найти общее окружение, где появился след фактора транскрипции.
ChIP-seq улучшает этот подход за счет использования новейших технологий секвенирования, но по-прежнему не может определить точный адрес следа.Прорыв произошел с ChIP-exo, разработанным Фрэнком Пью, доктором философии. и его коллегами из Университета штата Пенсильвания, который использует добавление фермента, называемого экзонуклеазой, для обрезки фрагментов ДНК в том месте, где связан фактор транскрипции.
Хотя этот последний метод обещал раскрыть точный адрес каждого фактора транскрипции, его практическая реализация оказалась неудачной.После нескольких попыток заставить технику ChIP-exo работать в ее лаборатории, Цайтлингер решила разработать свою собственную версию. Работая с ChIP-chip или ChIP-seq более 15 лет, Цайтлингер осознал, что гораздо меньшие количества ДНК, полученные с помощью ChIP-exo, очень затрудняют получение точной информации о последовательности. Помогая студенту, работающему над техникой несвязанной РНК, она увидела потенциальное решение.
Обычно, когда исследователи готовят полоску ДНК для анализа, они должны добавить дополнительный бит последовательности, который служит своего рода стартовой площадкой для механизма секвенирования.
Традиционно эта подготовка включает в себя два неэффективных этапа «лигирования», добавляя сначала бит последовательности сначала в начало, а затем в конец каждого образца.Цайтлингер и ее коллеги придумали способ достичь того же результата всего за один шаг лигирования, добавив немного последовательности к задней части фрагмента, а затем позволив нити образовать круг.
Кроме того, исследователи включили случайный штрих-код в фрагмент ДНК, который они использовали для лигирования, что позволило им обнаружить любые ошибки или артефакты, которые могли возникнуть в процессе секвенирования.Они назвали новый метод «ChIP-эксперименты с разрешением нуклеотидов с помощью экзонуклеазы, уникального штрих-кода и одиночного лигирования» или ChIP-nexus.
Когда они использовали ChIP-nexus для картирования следов четырех хорошо известных белков, а именно TBP человека и Drosophila NF-kappaB, Twist и Max, они обнаружили, что он постоянно превосходит существующие протоколы ChIP-seq по разрешающей способности и специфичности.Новый инструмент может отличать настоящие следы, созданные фактором транскрипции, который прочно сидит на определенной последовательности в течение длительного времени, от фонового шума, который, возможно, возник из-за того, что белок остановился на последовательности в поисках правильного места для приземления. Наличие лучшего сбора реальных следов, в свою очередь, обеспечивает гораздо более подробную информацию о последовательности о предпочтениях связывания факторов транскрипции.
Цайтлингер считает, что этот метод представляет собой важный шаг вперед в этой области и в конечном итоге заменит ChIP-seq в изучении регуляции генов.«У нас все еще есть очень упрощенное представление о том, как факторы транскрипции открывают ДНК и включают гены», — говорит Цайтлингер. «Если мы проведем такой анализ для множества факторов транскрипции, мы соберем информацию, необходимую для лучшего понимания экспрессии генов».В частности, она хотела бы увидеть методику, используемую для выяснения того, как небольшие изменения в ДНК — виды, которые естественным образом существуют в человеческой популяции — влияют на связывание факторов транскрипции и, следовательно, на различия в экспрессии генов от одного человека к другому.Работа финансировалась Институтом медицинских исследований Стоуэрса и грантом Национальных институтов здравоохранения (New Innovator Award 1DP2OD004561).
Авторы полностью несут ответственность за содержание и не обязательно отражают официальную точку зрения NIH.Краткое изложение выводовВ любой момент времени только часть генов в данной клетке экспрессируется или «включается».
Белки, называемые факторами транскрипции, действуют как молекулярные переключатели клетки, связывая определенные участки в ДНК, чтобы включать и выключать различные гены. Несмотря на их важность, исследователи все еще испытывают трудности с идентификацией сайтов связывания этих факторов транскрипции.
В текущем выпуске научного журнала Nature Biotechnology ученые Института Стоуэрса сообщают о разработке нового метода под названием ChIP-nexus, который может точно и надежно отображать эти участки, значительно превосходя предыдущие методы. Ассоциированный исследователь Стоуэрса Джулия Цайтлингер, доктор философии, возглавлявшая исследование, объясняет, что исследователи могут использовать новый метод, чтобы понять, как факторы транскрипции взаимодействуют с ДНК для контроля экспрессии генов.
Например, запатентованный метод уже показал, что сайты связывания факторов транскрипции не разбросаны по геному, как считалось ранее, а скорее появляются в определенных, предсказуемых последовательностях.