Теперь Нунцзянь (штат Нью-Джерси) Тао и его коллеги из Института биодизайна Университета штата Аризона описывают новый метод исследования малых молекул и их связи с мембранными белками. Исследование позволит ученым и клиницистам изучить эти взаимодействия в удивительно мелком масштабе с беспрецедентной точностью.
Новая работа имеет широкое значение для фундаментальных исследований биологической функции на клеточном уровне, а также обеспечивает эффективную платформу для разработки новых лекарств, которые можно проводить быстрее и точнее с меньшими затратами.Этот метод позволяет проводить первое прямое измерение в реальном времени кинетики связывания малых молекул с мембранными белками на интактных клетках без использования молекулярного мечения.
Исследование опубликовано в текущем выпуске журнала Science Advances.Целенаправленный подход«Большинство лекарств — это небольшие молекулы, и большинство лекарств-мишеней — это мембранные белки», — говорит Тао, руководитель Центра биодизайна биоэлектроники и биосенсоров, который занимается разработкой новых технологий обнаружения. «Определение связывания между небольшими молекулами и мембранными белками очень важно с фармацевтической точки зрения, но также и для понимания основных клеточных процессов».Точный дизайн лекарств требует понимания не только низкомолекулярных лекарств и мембранных белков, с которыми они связываются, но и информации о том, как этот процесс развивается с течением времени — так называемой кинетики связывания системы.
Скорость связывания лекарств с рецепторами и их диссоциации напрямую влияет на эффективность и безопасность лекарств.Оптимизация кинетики связывания позволяет разработчикам лекарств точно контролировать два критических параметра, известных как Кон и Кофф. Они представляют собой событие связывания малой молекулы с белком и диссоциацию маленькой молекулы.Традиционно такое исследование требовало удаления белков из их естественной среды на клеточных мембранах.
После извлечения из клетки мембранные белки иммобилизуются на поверхности и исследуются их взаимодействия с небольшими молекулами. К сожалению, поведение мембранных белков может измениться после извлечения из клеточной среды.Маленькие молекулы, используемые для большинства лекарств, имеют размер порядка нескольких сотен дальтон по сравнению с биологическими молекулами, которые часто составляют тысячи дальтон. (Дальтон примерно равен массе отдельного нуклона — протона или нейтрона.)Крошечный размер маленьких молекул затрудняет точное изучение кинетики связывания.
Этот факт сделал процесс проверки на наркотики трудным и дорогостоящим делом. Путь от открытия лекарств до конечной коммерциализации часто требует 10-12 лет исследований и около 1 миллиарда долларов на разработку одного нового лекарства.
Помимо изучения кинетики связывания мембранных белков, иммобилизованных на поверхности, испытания на животных часто используются для проверки новых лекарств, хотя затраты высоки, методы неэффективны и возникают этические проблемы. Кроме того, даже успешные результаты не всегда применимы к пациентам-людям.
Новый взглядВсе больше и больше область открытия лекарств перемещается в сторону высокопроизводительных методов скрининга на основе клеток, когда взаимодействия малых молекул и мембранных белков исследуются в их естественной среде. Однако в современных технологиях чувствительность, с которой можно обнаружить небольшие молекулы, зависит от их размера. Чем меньше становится молекула образца, тем труднее ее обнаружить.
Одним из популярных способов обнаружения является флуоресцентная маркировка молекул образца. Здесь частица красителя прикреплена к исследуемой молекуле, но молекула-метка может существенно изменить свойства исследуемых небольших молекул.Новый метод обеспечивает платформу для клеточных анализов с использованием стандартных методов микроскопии без использования флуоресцентного мечения.
Это первая возможность исследовать кинетику связывания в режиме реального времени с чрезвычайно высоким разрешением. Метод основан на том факте, что события связывания и диссоциации изменяют форму клеточной мембраны, деформируя ее.Процесс визуализации известен как дифференциальное оптическое обнаружение. Когда небольшая молекула сталкивается с поверхностным мембранным белком, она изменяет поверхностное натяжение мембраны. «Это изменение очень крошечное — всего несколько нанометров или меньше», — говорит Тао. «У нас есть способ отслеживать это изменение с большой точностью — с точностью до долей нанометра».
Кроме того, этот метод совместим с простой оптической микроскопией, хотя методы, включая фразовое контрастное изображение или поверхностный плазмонный резонанс (SPR), могут использоваться для повышения контрастности изображения.На краюДля тонкого обнаружения выбираются две области по краю клеточной мембраны.
Когда небольшая молекула связывается с белком, в результате деформируется мембрана. Эта механическая деформация определяется оптически по изменению интенсивности света.
Это непрямое обнаружение позволяет визуализировать чрезвычайно малые изменения клеточной мембраны с течением времени.Тао сравнивает этот процесс с методами, используемыми для открытия экзопланет — новых планет за пределами нашей солнечной системы. Хотя такие объекты слишком тусклые и далекие, чтобы их можно было обнаружить напрямую, свидетельства их присутствия могут быть получены по колебаниям звездного света из-за гравитационных эффектов, вызванных невидимыми экзопланетами.
В текущем исследовании фазово-контрастное изображение использовалось для обнаружения взаимодействий как больших, так и малых молекул с мембранными белками в реальном времени в интактных клетках. В то время как основное внимание уделялось обнаружению малых молекул, взаимодействия крупных молекул помогли подтвердить результаты, поскольку наблюдаемую кинетику связывания можно было сравнить с экспериментальными данными, полученными с помощью обычных средств обнаружения. Для обнаружения малых молекул команда Тао использовала мембранные белки, которые обнаруживают ацетилхолин — модельную систему, которая широко изучена.
Новый метод приближает исследование взаимодействий мембранный белок-мелкие молекулы к тому поведению, которое действительно имеет место в живых системах. Платформа совместима с клеточными анализами и обещает более быстрый, дешевый и точный дизайн лекарств, обеспечивая при этом новое понимание основополагающих проблем клеточной биологии.
«Мы очень взволнованы этой технологией и работаем над ее дальнейшим развитием», — говорит Тао, подчеркивая роль новой техники как в академических исследованиях, так и в фармацевтических лабораториях.Исследование проводилось при щедрой поддержке Фонда Гордона и Бетти Мур.