Новый метод визуализации основан на методе, называемом микроскопией одиночных молекул, путем добавления информации об ориентации и движении флуоресцентных красителей, прикрепленных к нити ДНК.W. E. Moerner, Стэнфордский университет, США, является основателем спектроскопии одиночных молекул, революционного метода с 1989 года, который позволил ученым впервые визуализировать одиночные молекулы с помощью оптической микроскопии. Из лауреатов Нобелевской премии 2014 г. по оптической микроскопии за пределами дифракционного предела (Moerner, Hell Бетциг), Мёрнер и Бетциг использовали одиночные молекулы для изображения плотного массива молекул в разное время.
В журнале оптических исследований Optica исследовательская группа во главе с Мёрнером описывает свою новую технику и демонстрирует ее, получая изображения сверхвысокого разрешения и измеряя ориентацию тысяч отдельных молекул флуоресцентного красителя, прикрепленных к нитям ДНК.«Вы можете думать об этих новых измерениях как о маленьких двуглавых стрелках, которые показывают ориентацию молекул, прикрепленных вдоль цепи ДНК», — сказал Мёрнер. «Эта информация об ориентации сообщает о локальной структуре оснований ДНК, потому что они ограничивают молекулу. Если бы у нас не было этой информации об ориентации, изображение было бы просто пятном».
Добавление дополнительной информации в наномасштабеНить ДНК — это очень длинная, но узкая нить, всего несколько нанометров в поперечнике. Одномолекулярная микроскопия вместе с флуоресцентными красителями, которые прикрепляются к ДНК, могут использоваться для лучшей визуализации этой крошечной струны. До сих пор было трудно понять, как эти красители ориентированы, и невозможно было узнать, прикреплен ли флуоресцентный краситель к ДНК жестким или несколько рыхлым образом.
Адам С. Бакер, первый автор статьи, разработал довольно простой способ получения ориентации и динамики вращения из тысяч отдельных молекул, параллельно. «Наша новая методика визуализации исследует, как каждая отдельная молекула красителя, маркирующая ДНК, выравнивается относительно гораздо более крупной структуры ДНК», — сказал Бакер. «Мы также измеряем, насколько колеблется каждая из этих молекул, что может сказать нам, застряла ли эта молекула в одном конкретном выравнивании или она колеблется в ходе нашей последовательности измерений».Новый метод предлагает более подробную информацию, чем современные методы так называемого «ансамбля», которые усредняют ориентацию группы молекул, и намного быстрее, чем методы конфокальной микроскопии, которые анализируют одну молекулу за раз.
Новый метод можно использовать даже для относительно тусклых молекул.Поскольку этот метод предоставляет наноразмерную информацию о самой ДНК, он может быть полезен для мониторинга изменений конформации ДНК или повреждения определенного участка ДНК, что проявляется в изменении ориентации молекул красителя. Его также можно использовать для отслеживания взаимодействий между ДНК и белками, которые управляют многими клеточными процессами.30 000 ориентаций одиночных молекул
Исследователи протестировали улучшенную технику визуализации ДНК, используя ее для анализа интеркалирующего красителя; тип флуоресцентного красителя, который скользит в области между основаниями ДНК. В типичном эксперименте по визуализации они получают до 300 000 местоположений одиночных молекул и 30 000 измерений ориентации одиночных молекул всего за 13 минут. Анализ показал, что отдельные молекулы красителя были ориентированы перпендикулярно оси нити ДНК и что, хотя молекулы имели тенденцию ориентироваться в этом перпендикулярном направлении, они также перемещались внутри ограниченного конуса.
Затем исследователи провели аналогичный анализ с использованием другого типа флуоресцентного красителя, который состоит из двух частей: одной части, которая прикрепляется к боковой стороне ДНК, и флуоресцентной части, которая соединяется с помощью гибкого троса. Усовершенствованная технология визуализации ДНК обнаружила эту гибкость, показав, что метод может быть полезен, помогая ученым понять, на основе молекулы за молекулой, прикрепляются ли различные метки к ДНК мобильным или фиксированным способом.
В статье исследователи продемонстрировали пространственное разрешение около 25 нанометров и измерения ориентации отдельных молекул с точностью около 5 градусов. Они также измерили вращательную динамику или гибкость одиночных молекул с точностью около 20 градусов.
Как это работаетЧтобы получить информацию об ориентации одной молекулы, исследователи использовали хорошо изученную технику, которая добавляет к микроскопу одиночных молекул оптический элемент, называемый электрооптическим модулятором. Для каждого кадра камеры это устройство изменяло поляризацию лазерного света, используемого для освещения всех флуоресцентных красителей.
Поскольку молекулы флуоресцентного красителя с ориентацией, наиболее близко совпадающей с поляризацией лазерного света, будут казаться самыми яркими, измерение яркости каждой молекулы в каждом кадре камеры позволило исследователям количественно оценить ориентацию и динамику вращения для каждой молекулы. Молекулы, которые переключались между яркими и темными в последовательных кадрах, были жестко ограничены определенной ориентацией, в то время как молекулы, которые казались яркими для последовательных кадров, не удерживали жестко свою ориентацию.
«Если у кого-то есть одномолекулярный микроскоп, он может довольно легко выполнить нашу технику, добавив электрооптический модулятор», — сказал Бакер. «Мы использовали довольно стандартные инструменты немного по-другому и проанализировали данные по-новому, чтобы получить дополнительную биологическую и физическую информацию».