«Проблема немного похожа на то, чтобы быть автомехаником и не иметь возможности увидеть двигатель или то, как он собран в деталях», — говорит Пол Алквист, директор вирусологии Института Моргриджа и профессор онкологии и молекулярной вирусологии Университета Висконсин-Мэдисон. «Эта работа — наш первый взгляд на двигатель».В исследовании, опубликованном 27 июня в журнале eLife, используется новаторская криоэлектронная томография, чтобы детально раскрыть сложный процесс репликации вируса, открывая новые возможности для потенциального нарушения, демонтажа или перенаправления вирусного механизма.Одна из нескольких целей лаборатории Ahlquist Lab — понять репликацию генома для вирусов с положительной цепью РНК, крупнейшего генетического класса вирусов, который включает в себя многие патогены человека, такие как вирусы Зика, Денге, ТОРС и Чикунгунья.
Группа изучает процессы стратегическим образом, сосредотачиваясь не на мелких деталях одного важного вируса, а на общих принципах, применимых ко всему классу.И почему акцент на репликации генома?«Большая часть вирусного генома, обычно порядка 75 процентов, передана на репликацию генома», — говорит Алквист. «Вирус говорит нам — голосуя своим самым ценным ресурсом, своей кодирующей способностью — что это большая работа заражения».Этот процесс происходит на мембранах инфицированной клетки.
Вирусы образуют компартменты репликации — по сути, новые органеллы, — в которых происходит процесс репликации генома. Нодавирус, используемый в качестве модели в лаборатории Алквиста, осуществляет этот процесс на митохондриальной мембране.
Неинфицированная митохондрия имеет две мембраны снаружи. В митохондриях, инфицированных вирусом, пространство между этими мембранами расширяется и заполняется сферулами, круглыми пузырьками размером около 50 нанометров.
Дезире Бенефилд, научный сотрудник лаборатории Алквиста в Институте Моргриджа, говорит, что все вирусы с положительной цепью РНК полагаются на перестройку мембраны хозяина и образование компартментов репликации для копирования своего генома. Это делает привлекательной мишенью противовирусные препараты широкого спектра действия, которые эффективны против широкого спектра вирусов.«С помощью этой захватывающей новой структурной информации мы можем узнать больше о том, как формируются и функционируют отсеки», — говорит Бенефилд. «Эта информация будет способствовать нашему пониманию вирусной репликации и даст представление о том, как ее контролировать».
Компартменты репликации или сферулы содержат нити РНК, генетического кода вируса. Именно в этих шариках происходит синтез РНК.
Затем продуктовые РНК удаляются из сферулы и используются для производства большего количества белков или упаковываются в новые инфекционные частицы для создания следующего поколения вирусов.По словам Бенефилда, новое использование криоэлектронной томографии (крио-ЭТ) позволило ученым увидеть репликационные компартменты с беспрецедентной детальностью.«Мы можем видеть структурные элементы, о которых раньше можно было только догадываться в результате биохимических и генетических экспериментов, а также поразительные новые особенности, о которых даже не догадывались».Традиционная электронная микроскопия имеет свои ограничения и требует ряда этапов, жестких по отношению к образцу: химическая фиксация, окрашивание тяжелыми металлами и заделка в пластик.
Процесс идет медленно, с использованием высокореактивных и опасных химикатов, а образец фиксируется и, следовательно, отображается в неестественном состоянии.Подготовка проб для крио-ЭТ проще и дает лучшие результаты. Образец мгновенно замораживают в течение наносекунды в жидкий этан, охлаждаемый жидким азотом. Поскольку он замораживается так быстро, образец остается в гораздо более естественном состоянии.
Молекулам воды также некогда организовываться и кристаллизоваться, поэтому лед становится стекловидным, стекловидным.В то время как крио-часть крио-ЭТ улучшает подготовку образцов, компонент томографии делает шаг вперед в визуализации, создавая трехмерные визуализации.
При использовании традиционной электронной микроскопии отсеки репликации выглядели удлиненными, почти футбольными. Техника фиксации сморщила сферулы, а их содержимое сморщилось. Cryo-ET показывает реальность — структуры довольно круглые, то есть они находятся под давлением, как воздушный шар, и заполнены нитями РНК, свернутыми как клубок пряжи. Размер шариков зависит от длины копируемой РНК.
«Сначала меня поразило то, насколько красивыми и изящными были эти конструкции», — говорит Бенефилд. «Я был поражен тем, насколько эффективно вирус реплицирует свою РНК и как он полностью кооптировал митохондрии клетки-хозяина, чтобы в конечном итоге произвести больше вируса. Это был взгляд за занавес действующего патогена, который действительно подавлял».Сферулы имеют шейку вдоль митохондриальной мембраны, которая открывается в цитоплазму. Именно здесь входят ингредиенты для репликации РНК и выходят продукты.
Одним из удивительных открытий стало существование структуры, напоминающей корону, которая находится на вершине шеи.Конструкция представляет собой высокоорганизованную, высокосимметричную чашку с 12 зубцами снаружи. Это структурная особенность, которая, вероятно, держит все вместе.
Если везикула представляет собой круглый шар под давлением, коронка похожа на перевязку этого шара с горлышком.Новые результаты также показывают, что короны содержат вирусные белки, которые считывают и копируют нити РНК, и могут представлять собой главный двигатель комплекса репликации генома. Предстоит еще многое сделать, чтобы усовершенствовать форму и функцию этих коронок, но выявление их существования и визуализация их структуры и симметрии — огромные шаги в правильном направлении.«Если мы хотим манипулировать этими комплексами и контролировать их, мы должны понимать их работу в деталях», — говорит Алквист. «Вы не можете понять, как что-то функционирует, если не знаете, как это выглядит и как это устроено».
По словам Алквиста, вирусы с положительной цепью РНК — это лишь один из шести различных классов вирусов. Становится все более очевидным, что образование компартментов репликации и, возможно, даже структур, связанных с короной, может быть общим для более чем одного класса.
«Хотя эти классы считались очень разными, есть параллели в трех из шести классов с точки зрения репликации генома», — говорит Алквист. «Это имеет эволюционные последствия и позволяет нам интегрировать результаты из разных систем для достижения неожиданных новых идей».