Новый метод основан на расширении ткани перед ее визуализацией с помощью обычного светового микроскопа. Два года назад команда Массачусетского технологического института показала, что можно увеличивать объемы тканей в 100 раз, что привело к разрешению изображения около 60 нанометров. Теперь исследователи показали, что повторное расширение ткани перед визуализацией может повысить разрешение примерно до 25 нанометров.Этот уровень разрешения позволяет ученым видеть, например, белки, которые объединяются в сложные структуры в синапсах мозга, помогая нейронам общаться друг с другом.
Это также может помочь исследователям составить карту нейронных цепей, говорит Эд Бойден, доцент кафедры биологической инженерии, мозга и когнитивных наук Массачусетского технологического института.«Мы хотим иметь возможность проследить проводку полных цепей мозга», — говорит Бойден, старший автор исследования. «Если бы вы могли реконструировать полную цепь мозга, возможно, вы могли бы создать вычислительную модель того, как он генерирует сложные явления, такие как решения и эмоции.
Поскольку вы можете составить карту биомолекул, которые генерируют электрические импульсы внутри клеток и которые обмениваются химическими веществами между клетками, вы могли бы потенциально моделировать динамику мозга ".Этот подход также можно использовать для визуализации других явлений, таких как взаимодействие между раковыми клетками и иммунными клетками, для обнаружения патогенов без дорогостоящего оборудования и для картирования типов клеток тела.Бывший постдок Массачусетского технологического института Джэ-Бьюм Чанг — первый автор статьи, опубликованной в выпуске журнала Nature Methods от 17 апреля.
Двойное расширениеЧтобы расширить образцы тканей, исследователи помещают их в плотный, равномерно образованный гель из полиакрилата, очень абсорбирующего материала, который также используется в подгузниках. Перед формированием геля исследователи маркируют клеточные белки, которые они хотят отобразить, с помощью антител, которые связываются с конкретными мишенями.
Эти антитела несут «штрих-коды», состоящие из ДНК, которые, в свою очередь, прикреплены к сшивающим молекулам, которые связываются с полимерами, составляющими расширяемый гель. Затем исследователи расщепляют белки, которые обычно удерживают ткань вместе, позволяя штрих-кодам ДНК расширяться друг от друга по мере набухания геля.
Эти увеличенные образцы затем могут быть помечены флуоресцентными зондами, которые связывают штрих-коды ДНК, и визуализированы с помощью коммерчески доступных конфокальных микроскопов, разрешение которых обычно ограничивается сотнями нанометров.Используя этот подход, исследователи ранее могли достичь разрешения около 60 нанометров. Однако «отдельные биомолекулы намного меньше этого, скажем, 5 нанометров или даже меньше», — говорит Бойден. «Первоначальные версии экспансионной микроскопии были полезны для решения многих научных вопросов, но не могли сравниться по производительности с методами визуализации с самым высоким разрешением, такими как электронная микроскопия».В своем первоначальном исследовании с помощью расширительной микроскопии исследователи обнаружили, что они могут расширить ткань более чем в 100 раз в объеме, уменьшив количество сшивающих молекул, которые удерживают полимер в упорядоченном виде.
Однако это сделало ткань нестабильной.«Если вы уменьшите плотность сшивающего агента, полимеры больше не сохранят свою организацию в процессе расширения», — говорит Бойден, член Media Lab Массачусетского технологического института и Института исследований мозга Макговерна. «Вы теряете информацию».Вместо этого в своем последнем исследовании исследователи модифицировали свою технику так, чтобы после первого расширения ткани они могли создать новый гель, который набухает во второй раз — подход, который они называют «итеративным расширением».
Схемы отображенияИспользуя итеративное расширение, исследователи смогли получить изображения тканей с разрешением около 25 нанометров, что аналогично тому, которое достигается методами высокого разрешения, такими как микроскопия стохастической оптической реконструкции (STORM). Однако, по словам Бойдена, экспансионная микроскопия намного дешевле и проще в выполнении, поскольку не требуется специального оборудования или химикатов. Этот метод также намного быстрее и, следовательно, совместим с крупномасштабной трехмерной визуализацией.
Разрешение расширительной микроскопии еще не соответствует разрешающей способности сканирующей электронной микроскопии (около 5 нанометров) или просвечивающей электронной микроскопии (около 1 нанометра). Однако электронные микроскопы очень дороги и не широко доступны, и с этими микроскопами исследователям трудно маркировать определенные белки.
В статье Nature Methods команда MIT использовала итеративное расширение для изображения синапсов — связей между нейронами, которые позволяют им общаться друг с другом. В своем первоначальном исследовании с помощью экспансионной микроскопии исследователи смогли отобразить каркасные белки, которые помогают организовать сотни других белков, обнаруженных в синапсах. С новым улучшенным разрешением исследователи также смогли увидеть структуры более мелкого масштаба, такие как расположение рецепторов нейромедиаторов, расположенных на поверхности «постсинаптических» клеток на принимающей стороне синапса.
«Я надеюсь, что в ближайшие годы мы действительно сможем начать картировать организацию этих каркасных и сигнальных белков в синапсах», — говорит Бойден.Он считает, что сочетание экспансионной микроскопии с новым инструментом, называемым временным мультиплексированием, должно помочь в достижении этого. В настоящее время только ограниченное количество цветных зондов можно использовать для изображения различных молекул в образце ткани.
Благодаря временному мультиплексированию исследователи могут пометить одну молекулу флуоресцентным зондом, сделать снимок и затем смыть зонд. Затем это можно повторять много раз, каждый раз используя одни и те же цвета для обозначения разных молекул.«Комбинируя итеративное расширение с временным мультиплексированием, мы могли бы в принципе получать изображения практически бесконечных цветов с наноразмерным разрешением на больших трехмерных объемах», — говорит Бойден. «Сейчас все становится по-настоящему захватывающим, потому что эти разные технологии могут скоро соединиться друг с другом».Исследователи также надеются достичь третьего раунда расширения, которое, по их мнению, в принципе может обеспечить разрешение около 5 нанометров.
Однако прямо сейчас разрешение ограничено размером антител, используемых для мечения молекул в клетке. Эти антитела имеют длину от 10 до 20 нанометров, поэтому, чтобы получить разрешение ниже этого, исследователям необходимо сначала создать более мелкие метки или расширить белки друг от друга, а затем доставить антитела после расширения.