Обсуждая, почему наличие таких карт является важным достижением, д-р Пеер объясняет: «Существует так много болезней, которые возникают в результате сбоев в молекулярных программах, контролирующих развитие репертуара наших клеток, и так много редких, но важных регуляторных факторов. типы клеток, которые нам еще предстоит открыть. Мы сможем по-настоящему понять, что идет не так с этими заболеваниями, только если у нас будет полная карта прогрессирования нормального развития. Такие карты также будут служить компасом для регенеративной медицины, потому что это очень трудно выращивать что-то, если вы не знаете, как это развивается в природе. Впервые наш метод позволяет построить карту с высоким разрешением на уровне отдельной клетки, которая может служить ориентиром для подобных исследований ».
Хотя общепринятая догма характеризует развитие как серию дискретных шагов, на самом деле клетки развиваются в процессе непрерывной трансформации. По мере созревания клетки сложные и взаимосвязанные молекулярные программы, регулирующие ее активность, постепенно меняются. Эти программы также могут значительно отличаться среди клеток одного типа, и для многих важных типов регуляторных клеток редкие отклонения в этих программах могут иметь разрушительные последствия.
Раньше было трудно наблюдать эти тонкие различия с достаточной детализацией, чтобы различить их, но теперь новые технологии открывают важные новые возможности.Подобно тому, как секвенирование генома изменило то, как изучалась биология в предыдущее десятилетие, новые технологии анализа молекулярных свойств отдельных клеток в настоящее время революционизируют вопросы, которые задают многие биологи. Доктор Пеер рассматривает одноклеточные подходы как важный шаг за пределы геномики. «Секвенирование ДНК может идентифицировать гены и мутации, но часто они не изучаются в контексте», — отмечает она. «Используя одноклеточные подходы, мы можем отобразить клетки, в которых на самом деле происходит действие, и то, что гены делают внутри них».
В исследовании, описанном в статье Cell, исследователи использовали новую технологию, называемую массовой цитологией, которая в одном эксперименте может измерять 44 молекулярных маркера одновременно в миллионах отдельных клеток. Это обеспечивает множество данных, которые можно использовать для сравнения, категоризации и хронологического упорядочения клеток, а также позволяет начать идентификацию молекулярных систем, ответственных за развитие, гораздо более детально, чем это было возможно раньше.Использование преимуществ этих сложных одноклеточных данных также потребовало от исследователей разработки новых математических и вычислительных методов их интерпретации. Подобно тому, как физический объект можно представить в трех измерениях — длине, ширине и высоте — подход лаборатории Пеера включал в себя рассмотрение 44 измерений как 44-мерного геометрического объекта.
Затем они разработали новый вычислительный алгоритм под названием Wanderlust, который использует математические концепции из области, называемой теорией графов, для преобразования этих многомерных данных в простую форму, которую легче интерпретировать.
Нам невозможно визуализировать такую многомерную геометрию, и поэтому Wanderlust преобразует набор измерений важных маркеров развития в каждой клетке в единую одномерную величину, которая соответствует месту клетки в хронологии развития. Чтобы правильно разместить каждую ячейку, Wanderlust преобразует многомерную геометрию в граф, где каждая отдельная ячейка представлена в виде точки, соединенной линией (также называемой ребром) с другими ячейками, которые наиболее похожи на нее. Клетки, которые находятся ближе всего по траектории развития, отображаются на графике близко друг к другу, в то время как клетки, находящиеся на разных стадиях развития, отображаются дальше.
Включая все сотни тысяч профилированных ячеек, этот график не разделяет ячейки на категории, а представляет непрерывную новую геометрию, которая фиксирует всю траекторию развития.По словам доктора Пеэра: «В течение многих лет математика использовалась в физике, чтобы показать, что существуют очень элегантные математические отношения, которые определяют способ построения Вселенной. Если взглянуть с точки зрения математики, мы видим, что сложность найденный в биологии, также красиво структурирован и структурирован. В нашем теле есть триллионы клеток бесчисленного множества различных типов, каждый из которых имеет разные молекулярные особенности и поведение.
Эта сложность расширяется от одной клетки в рамках тщательно регулируемого процесса, называемого развитием. Эта регуляция создает закономерности и формы в многомерных данных, которые мы измеряем. Используя Wanderlust для анализа этих данных, мы можем найти закономерность и проследить траекторию, по которой следует клеточное развитие ".Чтобы проверить свой подход, исследователи изучили развитие В-клеток человека, типа клеток, которые важны для адаптивного иммунного ответа и участвуют в различных аутоиммунных заболеваниях, а также в некоторых типах рака.
Поскольку иммунные клетки продолжают развиваться на протяжении всей взрослой жизни, даже один образец из одного костного мозга содержит клетки всех стадий развития B-клеток. Исследователи из лаборатории Нолана использовали массовую цитометрию для профилирования 44 маркеров в когорте из примерно 200 000 здоровых иммунных клеток, собранных из одного такого образца. В каждой клетке они измерили маркеры клеточной поверхности, которые помогают определить, какой это тип клетки, а также маркеры внутри клетки, которые могут выявить, что делает клетка, включая маркеры передачи сигналов, клеточного цикла, апоптоза и перестройки генома.Используя Wanderlust для анализа многомерных данных, полученных с помощью массовой цитометрии, исследователи точно упорядочили всю траекторию 200000 клеток в соответствии с их хронологией развития.
В качестве убедительного доказательства его точности, Wanderlust захватил и правильно упорядочил все основные молекулярные ориентиры, которые, как известно, присутствуют в развитии В-клеток человека. Уандерласт также определил ряд ранее неизвестных ключевых контрольных точек регуляторной передачи сигналов, необходимых для развития В-клеток человека, а также не охарактеризованных подтипов предшественников В-клеток, которые соответствуют важным стадиям развития.
Эта траектория представляет собой наиболее полный анализ развития В-клеток человека, который когда-либо проводился.В знак высокой степени точности, которую Wanderlust предлагает для изучения отдельных клеток, исследователи также сообщают, что они выявили редкие, ранее неизвестные сигнальные события, связанные с сигнальным белком STAT5, которые произошли всего в 7 из 10 000 клеток. Это регуляторное событие вовлечено в процесс рекомбинации VDJ, непостоянное время, когда B-клетка перетасовывает свою собственную ДНК. Дальнейшие лабораторные эксперименты показали, что нарушение этих сигнальных событий с помощью ингибиторов киназ полностью остановило развитие В-клеток.
Выявление и характеристика регуляторных контрольных точек, которые контролируют и отслеживают судьбу клеток, могут иметь множество практических применений, поскольку многие заболевания возникают в результате дисбаланса типов клеток, продуцируемых иммунной системой. Таким образом, подход, описанный авторами, может дать понимание, которое может быть использовано для разработки новых диагностических и терапевтических средств.Этот процесс отображения того, как развиваются здоровые клетки, можно применить не только к В-клеткам, но и к любому типу клеток.
Как предполагают авторы, их метод дает возможность заложить основу для изучения нормального развития, а также процессов, ответственных за любой вид патологии развития. В будущем они ожидают, что могут быть построены более сложные модели, которые будут способны отображать даже более сложные системы, такие как вся иммунная система.
Святой Грааль будет включать создание полной карты каждого типа клеток в организме и того, как каждый из них прогрессивно развивается из одной стволовой клетки, точно определяя судьбу каждой клетки на этом пути.Достижение этой цели потребует гораздо большей работы, но, как отмечает доктор Пеер: «Этот текущий проект является важной вехой как в изучении развития, так и в исследованиях отдельных клеток, и полностью изменил мое представление о науке. . Был зажжен огонь, и эти результаты — лишь верхушка айсберга того, что сейчас возможно ».